喜樹堿多功能納米顆粒有效實現(xiàn)了乳腺癌治療療效與維持腸道穩(wěn)態(tài)之間的平衡

喜樹堿多功能納米顆粒有效實現(xiàn)了乳腺癌治療療效與維持腸道穩(wěn)態(tài)之間的平衡

喜樹堿（CPT） 是一種有效的化療藥物，對包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥都有活性。在臨床試驗的初始階段，CPT 被配制成 CPT 鈉鹽，以在生理 pH 值下實現(xiàn)其非活性羧酸鹽形式 （CPT-Na） 和活性內(nèi)酯形式 （CPT） 之間的微妙平衡。然而，這些試驗中納入的患者表現(xiàn)出劑量依賴性骨髓抑制、出血性膀胱炎和重度GAE（包括腹瀉、惡心和嘔吐），導致治療停止。直到發(fā)現(xiàn)其獨特的抑制 DNA 拓撲異構(gòu)酶的抗腫瘤機制，CPT 才在抗腫瘤研究中重新受到重視。從 CPT 結(jié)構(gòu)開發(fā)的衍生物，如伊立替康和拓撲替康，提高了水溶性并減輕了相關(guān)的 GAE。然而，盡管有這些改善，GAEs的發(fā)病率仍然很高，這嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。重要的是，這些衍生物的抗腫瘤活性低于 CPT ，這可能會影響治療效果，甚至危及患者的生命。

新型納米藥物遞送系統(tǒng)利用納米材料的特性，使水不溶性藥物在水中具有出色的分散性、延長循環(huán)時間、腫瘤靶向能力以及在腫瘤內(nèi)的顯著積累。此外，某些納米材料具有固有特性，如光熱和光動力效應，可以有效增強抗腫瘤治療的療效。這些納米材料特性為提高CPT 的治療效果同時最大限度地減少不良反應提供了有希望的機會。在過去的二十年里，已有超過 15 種納米藥物被批準用于臨床。此外，幾種基于 CPT 的納米藥物已進入臨床試驗，其中基于 CPT 的抗體藥物偶聯(lián)物 （CPT-ADC） 尤其值得注意。然而，實現(xiàn)一個以正確比例平衡這三個部分的公式對科學家來說是一個挑戰(zhàn)。基于光熱療法的聯(lián)合療法旨在增強 CPT-ADC 的腫瘤靶向性，從而有效提高這種腫瘤治療的療效并減少潛在的副作用。在以前的研究中，我們的研究小組利用美國食品和藥物管理局批準的試劑普魯士藍 （PB） 來設計和合成用于腫瘤靶向的 PCRHN。PB 的光熱效應的結(jié)合增強了 CPT 的抗腫瘤功效，該系統(tǒng)減輕了重要器官的不良反應。然而，之前報道的 CPT 的 GAE 沒有在該系統(tǒng)中進行調(diào)查。考慮到 CPT 的強 GAE以及化療誘導的 GAE 可能導致劑量減少、治療周期縮短甚至停藥，這可能導致化療失敗并對患者生命構(gòu)成威脅，有必要研究 PCRHNs 的 GAE。

大量研究表明，化療誘導的GAE 與胃腸道微環(huán)境的改變有關(guān)，其中腸道屏障和微生物群起著至關(guān)重要的作用。腸上皮細胞和緊密連接蛋白之間的相互作用導致腸道屏障的形成，這對維持腸道穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。該屏障隔離腸道內(nèi)的腸道微生物群，從而防止有害物質(zhì)穿過并調(diào)節(jié)腸道通透性。當化療藥物抑制快速增殖的腫瘤細胞時，腸上皮細胞由于其增殖周期短、生長速度快而容易受到藥物的攻擊，從而導致腸道損傷。該過程主要導致腸道通透性增加和腸上皮細胞凋亡，腸道緊密連接蛋白減少，導致化療引起的腹瀉。

腸道屏障的損傷通常會導致腸道微生物群組成的改變。腸道微生物群對食物的分解為腸道細胞提供能量和營養(yǎng)，而腸道中的某些微生物可以提高化療的敏感性并減輕不良反應。然而，某些腸道微生物與化療的毒副作用有關(guān)。此外，化療藥物可以直接影響腸道微生物群并導致生態(tài)失調(diào)。這包括腸道微生物多樣性和豐度的減少，以及微生物組成從更“有益”的共生微生物（如雙歧桿菌和乳酸桿菌）轉(zhuǎn)變?yōu)楦爸虏　钡奈⑸铮òㄋ缶湍c桿菌科）。腸道菌群的菌群失調(diào)可能導致粘膜炎，從而加劇癌癥的臨床病程。

腸道屏障和微生物群在人體生理學和病理學中起著重要作用，但化療藥物納米物質(zhì)化對這些過程的影響仍然知之甚少。在先前研究的基礎上，我們進行了一項比較研究，以評估PCRHNs 和不同劑量的游離 CPT 的治療效果，以及它們對腸道屏障功能和微生物群的影響。這項研究為納米藥物對 GAE 的影響提供了有價值的見解，從而為評估納米藥物的安全性奠定了基礎。

PCRHN 的表征

根據(jù)我們之前的研究，我們制備了PCRHNs 。PCRHN 的平均直徑為 164 ± 0.3 nm （圖 1接下來，研究了納米顆粒的形態(tài)，如圖 1B.PCRHN 的粒徑和形態(tài)與先前研究中報道的相似 。此外，PCRHNs 表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。即使在鹽水中孵育數(shù)天后，PCRHN 也沒有顯示出任何聚集跡象，并且 PDI 值只有很小的變化，這一發(fā)現(xiàn)得到了支持。通過研究在存在和不存在 GSH 的情況下 PCRHN 釋放 CPT 來驗證納米顆粒對還原條件的敏感性。如圖 1C，在無 GSH 的情況下，CPT 的釋放速率較慢。然而，在 GSH （5.0 mmol/L） 存在下，CPT 以相對較快的速度釋放，并在48小時后達到 80% 的釋放。許多研究表明，腫瘤細胞中的細胞內(nèi)GSH濃度可以達到2-20 mM，比細胞外基質(zhì)中的GSH濃度高100-1000倍，比正常組織中的GSH濃度高7-10倍。這些結(jié)果表明，與游離 CPT 相比，PCRHNs 表現(xiàn)出更慢且更穩(wěn)定的釋放速率，同時還表現(xiàn)出響應腫瘤細胞內(nèi) GSH 的快速釋放 CPT 的能力。隨后檢查了 PCRHN 的光熱特性。紅外熱圖像 （圖 1D） 和光熱加熱曲線 （圖 1E） 顯示 PCRHNs 和 PB NPs 在 808 nm 激光照射下的溫度升高沒有顯著差異。此外，即使經(jīng)過 5 次照射和冷卻循環(huán)后，PCRHNs 的溫度仍保持一致，表明具有出色的光熱穩(wěn)定性 （圖 1F）. 這些發(fā)現(xiàn)與以前的研究一致。

體內(nèi)抗腫瘤活性

研究表明，在平衡化療治療乳腺癌的有效性和毒性方面存在挑戰(zhàn)。先前的研究表明，PCRHNs 對治療乳腺癌有效。然而，對 PCRHNs 治療引起的 GAE 發(fā)生率的研究有限 。本研究旨在比較 PCRHNs 與高劑量 CPT 治療的療效和 GAEs，給藥時間表如下圖 2一個。結(jié)果表明，5 mg/kg 和 8 mg/kg CPT 的治療效果顯著優(yōu)于 2 mg/kg CPT，表明游離 CPT 以劑量依賴性方式抑制腫瘤生長。圖 2B 和 C，圖 S3）。通過觀察腫瘤細胞凋亡 （圖 2D） 和增殖 （圖 2然而，5 mg/kg 和 8 mg/kg CPT 治療的治療效果顯著低于 PCRHNs + 激光治療組 （CPT 濃度為 2 mg/kg）。此外，在鹽水或 PCRHNs + 激光處理組的心臟、肝臟、脾臟、肺或腎臟的 H&E 染色切片中未觀察到組織形態(tài)或炎性細胞浸潤的明顯改變（圖 S4）。這些發(fā)現(xiàn)表明，與高劑量游離 CPT 療法相比，PCRHNs + 激光療法可以獲得卓越的治療效果。

體外和體內(nèi)腸道屏障

根據(jù)其抗腫瘤療效，我們研究了PCRHNs、PCRHNs + 激光治療和不同劑量的 CPT 對腸道屏障的影響。增加劑量的 CPT 導致緊密連接的 Caco-2 細胞逐漸松動，細胞邊界越來越模糊。然而，PCRHNs 處理組和鹽水組之間 Caco-2 細胞的形態(tài)沒有顯著差異 （圖 3此外，Caco-2 細胞的免疫熒光染色顯示，緊密連接蛋白 ZO-1 （圖 3B）、Occludin （圖 3C） 和 Claudin-1 （圖 3D） 隨著 CPT 劑量的增加而降低。然而，PCRHNs 處理組和生理鹽水組之間這些緊密連接蛋白的表達沒有顯著差異。

在體外評估腸道屏障后，我們繼續(xù)對腸道屏障進行體內(nèi)評估。首先，我們發(fā)現(xiàn)從治療的第4 天到第 8 天，接受 8 mg/kg 劑量的小鼠體重減輕的百分比顯著大于其他治療組（圖 4給藥后第 5 天，8 mg/kg 組小鼠在肛門處表現(xiàn)出糞便粘附和盲腸和結(jié)腸中大量液體的積累，而其他組未觀察到此類現(xiàn)象（圖 4隨后，我們在第 7 天進行了一項腸道通透性研究，這是腸道粘膜損傷的指標，是評估腸道屏障完整性的關(guān)鍵參數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)，與劑量為 8 mg/kg 的自由 CPT 治療相比，PCRHNs + 激光治療導致血管中 FITC-葡聚糖的暴露量顯著降低（圖 4C）。用 8 mg/kg CPT 處理的小鼠表現(xiàn)出最短的結(jié)腸長度 （圖 4D 和 E）。隨后，我們研究了腸道細胞凋亡，以進一步評估不同治療組之間的腸道損傷程度。這些發(fā)現(xiàn)表明，與其他治療組相比，高劑量 CPT（5 mg/kg 和 8 mg/kg）的給藥導致結(jié)腸上皮中 TUNEL 陽性細胞增加 （圖 4研究表明，腫瘤細胞抑制的療效與給藥藥物的劑量呈正相關(guān);然而，較高的劑量可能會引起脫靶效應，如毒性。本研究表明，高劑量 CPT 誘導的脫靶效應會導致腸道損傷的發(fā)生。

此外，我們對結(jié)腸中緊密連接蛋白的分布和表達進行了比較分析。ZO-1、Occludin 和 Claudin-1 是在腸道內(nèi)建立緊密連接的關(guān)鍵蛋白，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。免疫熒光分析顯示 ZO-1 蛋白水平無顯著差異 （圖 5A）、Occludin （圖 5B） 或 Claudin-1 （圖 5C） 在 PCRHNs、PCRHNs + 激光和鹽水中。然而，這些蛋白質(zhì)在用高劑量游離 CPT （5 mg/kg 和 8 mg/kg） 處理的小鼠的腸道中顯著低于 PCRHNs、PCRHNs + 激光和鹽水組。此外，PCRHNs + 激光組 ZO-1、Occludin 和Claudin-1 的表達模式和 mRNA 水平顯著高于高劑量 CPT 治療組 （圖 5）這些發(fā)現(xiàn)與免疫熒光分析獲得的結(jié)果一致。

這些發(fā)現(xiàn)表明，高劑量的CPT 可以增加腸道通透性，誘導腸上皮細胞凋亡，減少腸道內(nèi)緊密連接蛋白的分布和表達，從而對腸道組織造成顯著損害。與高劑量 CPT 相比，PCRHNs + 激光療法在保持腸道屏障功能的完整性方面具有更大的優(yōu)勢。

腸道菌群的調(diào)節(jié)

我們之前的研究結(jié)果表明，化療藥物對腸道微生物群的影響因劑量而異，腸道微生物群與治療結(jié)果之間可能存在相關(guān)性。在這項研究中，我們分析了暴露于不同治療的小鼠的腸道微生物群組成，序列數(shù)據(jù)已存入國家生物技術(shù)信息中心（NCBI） 序列讀取檔案 （SRA） 數(shù)據(jù)庫，登錄號為 PRJNA1136424。為了評估各種治療對腸道微生物群的影響，我們利用 Bray-Curtis 分析進行基于 OTU 的 PCA。PCA 結(jié)果顯示，8 mg/kg 游離 CPT 小鼠和其余組 （圖 6之后，我們檢查了腸道微生物群的多樣性和豐度。與其他組相比，多樣性 （圖 6B） 和豐度 （圖 6C） 8 mg/kg 治療組腸道菌群顯著降低。PCRHNs + 激光治療組腸道菌群多樣性低于 PCRHNs 組（圖 6B)。然而，兩組之間的豐度沒有顯著差異 （圖 6）。據(jù)報道，腸道菌群的多樣性和豐度與疾病的發(fā)生和治療有關(guān)，較高的多樣性和豐度可能有助于患者的健康。

對屬水平微生物群組成的進一步分析顯示，8 mg/kg CPT 處理組 Escherichia-Shigella 的豐度顯著增加 （圖 6D 和 E）。這種細菌能夠穿透上皮細胞并誘導巨噬細胞釋放 IL-1β，從而進一步觸發(fā)腸道炎癥。乳酸菌的豐度隨著 CPT 劑量的增加而降低。令人驚訝的是，PCRHNs 組乳酸菌的相對豐度顯著低于 PCRHNs + 激光組 （圖6D和F）。乳酸菌屬是革蘭氏陽性、兼性厭氧或微需氧細菌，作為益生菌廣泛用于各個領域。隨后進行 LEfSe 分析，LDA 評分為 4，以比較 PCRHNs 組和 PCRHNs + 激光治療組在物種水平上確定重要的生物標志物。我們發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌是富含 PCRHNs + 激光治療組 （圖 6G 和 H）。這種細菌是一種兼性厭氧微生物，通過對抗感染、減輕炎癥、增強免疫力和促進腸道穩(wěn)態(tài)來促進人類健康。

8 mg/kg 治療組與其他治療組之間的腸道菌群存在顯著差異，這使我們推測高劑量 CPT 是否抑制了某些細菌的生長。為了證實這一假設，通過與 CPT 溶液的體外共培養(yǎng)研究了不同濃度的 CPT 對細菌羅伊氏乳桿菌、大腸桿菌和志賀氏菌的影響。當同一細菌暴露于 PCRHN 或不同濃度的 CPT 時，觀察到的細菌菌落數(shù)量沒有顯著變化 （圖 7A 和 B）。然而，在相同濃度的 CPT 下，羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的菌落比大腸桿菌和志賀氏菌屬少。鑒于上述發(fā)現(xiàn)，我們假設 8 mg/kg 治療組小鼠腸道微生物群中埃希氏菌-志賀氏菌的富集可歸因于細菌生長速率。隨后，測量了這些細菌的生長速率，結(jié)果顯示大腸桿菌和志賀氏菌的生長速率明顯快于羅伊氏乳桿菌 (圖 7C).

研究表明，伊立替康是CPT 的衍生物，可增加腸道通透性并導致腹瀉 。診斷為腹瀉性腸易激綜合征的患者通常表現(xiàn)為結(jié)腸運輸增強、腸道微生物多樣性減少和腸桿菌科水平升高。此外，Cheng等人證明，一些補充的細菌能夠占據(jù)以前由人類腸道微生物群成員占據(jù)的生態(tài)位。在本研究中，與上述報告類似，我們觀察到在 8 mg/kg 的劑量下小鼠腸道通透性顯著增加（圖 4C）. 通透性的這種增加導致大量液體流入腸腔 （圖 4B） 導致小鼠腹瀉。同時，高頻率的腹瀉導致多樣性 （圖 6B） 和豐度 （圖 6C） 腸道微生物群。此外，在本研究中，在 8 mg/kg 治療組中觀察到埃希氏菌-志賀氏菌的富集 （圖 6D 和 E）。基于這些實驗結(jié)果以及不同劑量 CPT 對羅伊氏乳桿菌、大腸桿菌和志賀氏菌體外生長的影響，我們懷疑高劑量的 CPT 可能會引發(fā)腹瀉，同時降低腸道微生物載量。此外，特定微生物（如埃希氏菌-志賀氏菌）的快速增殖可能使它們占據(jù)其他微生物留下的生態(tài)位。

除了不同劑量的CPT 誘導的腸道菌群變化外，我們還觀察到 PCRHNs 治療組和 PCRHNs + 激光治療組之間的腸道菌群差異。PCRHNs + Laser 組乳酸菌豐度顯著大于 PCRHNs 組 （圖 6D–F、圖 6G），這些物種是兼性厭氧或微需氧細菌，作為益生菌廣泛用于各個領域。PCRHNs + 激光治療似乎促進了兼性厭氧菌和微需氧細菌的生長。

為了驗證這一假設，我們再次進行了實驗，比較了PCRHNs 和 PCRHNs + 激光治療對腸道菌群的影響，序列數(shù)據(jù)已存入SRA 數(shù)據(jù)庫，登錄號為 PRJNA1136405。與第一個實驗類似，PCRHNs + 激光組的乳酸菌豐度顯著大于 PCRHNs 組（圖 S5）。LEfSe 分析顯示臺灣乳桿菌 （Acinetobacter towneri， L.） 富集。PCRHNs + 激光組中的 reuteri、Staphylococcus succinus 和 Actinobacillus capsulatus（圖 S6）。L. taiwanensis ， A.towneri ， L.reuteri 和 S.琥珀菌屬被歸類為兼性厭氧菌，而 A.莢膜被歸類為需氧細菌。值得注意的是，這些細菌都不是專性厭氧菌。

對PCRHNs + 激光組中兼性厭氧菌和需氧菌的富集很感興趣，我們隨后進行了分析以確定這種現(xiàn)象的根本原因。腫瘤組織和細胞的過氧化氫水平明顯高于正常組織和細胞。此外，PB NPs在50℃的最佳溫度下表現(xiàn)出催化過氧化物酶活性。研究表明，結(jié)腸的微生態(tài)環(huán)境主要由專性厭氧菌居住。基于上述證據(jù)，我們懷疑激光照射會在腫瘤部位誘導局部熱療，從而加速過氧化氫向氧氣的轉(zhuǎn)化并增加全身氧水平。這最終促進了兼性厭氧菌和需氧菌的生長。

為了驗證這一假設，我們進行了相關(guān)的體內(nèi)和體外實驗。氧氣可以將脫氧血紅蛋白轉(zhuǎn)化為含氧血紅蛋白（HbO₂)。我們評估了HbO₂腫瘤值，并發(fā)現(xiàn)PCRHNs + 激光組顯著大于 PCRHNs 組 （圖 8A 和 B）。隨后，我們對 PCRHNs 和 PCRHNs + 激光組的氧氣產(chǎn)生進行了體外研究，同時監(jiān)測整個過程中的溫度波動。我們發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境溫度下，PCRHNs 和 PCRHNs + 激光組之間的氧氣產(chǎn)生沒有顯著差異 （圖 8C），并且在此過程中未觀察到溫度的顯著變化 （圖 8我們小組之前進行的研究發(fā)現(xiàn)，濃度為 0.02 mg/mL 的 PCRHNs 溶液在激光照射下沒有明顯的加熱。在本研究中，PCRHNs + Laser 組 （PCRHNs 濃度為 0.005 mg/mL） 在體外制氧過程中未觀察到顯著溫度變化，這可能歸因于 PCRHNs 濃度低。由于 PCRHNs + 激光組小鼠的腫瘤溫度在 NIR 激光照射 5 min 后迅速升高至 52.8℃，我們通過在水浴中逐漸升高系統(tǒng)的溫度并在此過程中監(jiān)測氧氣產(chǎn)生，在體外模擬了這一過程。值得注意的是，在 PCRHN 存在的情況下，氧氣產(chǎn)生量隨著加熱的進行而迅速增加 （圖 8這些發(fā)現(xiàn)與以前的報道一致，后者表明確定PB NPs的過氧化氫酶活性的最佳溫度為50℃）。

這些研究表明，乳酸菌在PCRHNs + 激光組中富集，這可能是由于快速激光照射誘導的腫瘤部位加熱。這導致過氧化氫酶活性增加，導致腫瘤內(nèi)通過催化轉(zhuǎn)化為氧氣的過氧化氫增加，最終導致氧含量總體增加。這些因素有利于兼性厭氧菌（如乳酸菌）和需氧菌的增殖。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X24003153?via%3Dihub